方法
我们进行了不同的模拟，以了解与脂质双层的蜂毒肽相互作用的不同阶段; I）其平行于表面构象的初始吸附到双层表面，随后II）将肽从平行于跨膜构象重新取向。
我a）将蜂毒素从水中结合到双层：伞取样模拟。要了解蜂毒肽与双层结合的热力学，需要找到结合自由能。这需要非常大的计算来适当地对肽的所有构型进行适当的采样。在肽不是柔性且可以被认为是刚性棒的情况下，可以对棒和双层之间的一组不同的角度进行计算。最后，这些自由能，每个计算给定的角度，可以适当地总结[13]。由于蜂毒素不是刚性棒，因此这种策略将不起作用。此外，据了解，蜂毒素在接近双层时经历结构转变：在远离双层的情况下，它是线圈，当吸附到脂质双层表面时，蜂毒素转化成螺旋。鉴于从使用蜂毒素模拟获得准确的定量热力学信息的困难，我们决定获得蜂毒肽吸附的热力学感觉，并且还研究蜂胶中的结构转化是否与双层的距离发生作用。因此，我们用蜂毒素进行伞取样计算，探索其构象的一个子集：当蜂毒素以平行方向接近双层时。为此，我们将蜂毒素的晶体结构平行于双层，其中心质量在距离双层中心沿着z方向5.0至2.6nm之间的13等距离位置处。伞电位的力常数为200 kJ / mol。
我b）限制性蜂毒素的定期MD模拟：为了验证来自伞抽样模拟的观察结果，我们进行了一个常规的MD模拟，其中放置两个蜂毒肽（每个小叶上一个），正好位于头组区域（距离双层中心约3 nm） ）。我们使用两种肽来改进抽样。观察到伞的取样模拟结合，观察到随着肽接近双层，其具有使其疏水侧面向水并且亲水侧面向脂质头部的取向。因此，在建立常规MD运行系统的同时，将两个肽定向为使得其亲水侧面向双层头组区域，并且疏水侧面向水。
II a）将蜂毒肽从平行构象重新定向为跨膜构象：通过拉起前三个残基的质心来研究蜂毒肽分子从平行于垂直取向的P / L = 1/128的重新取向的蜂毒素的N-末端。将这些残留物从双层的上部叶片拉至下部小叶。为简单起见，蜂毒肽N末端的前三个残基称为牵拉组。将牵拉组置于距离小叶中磷酸基团的中心距离3.4nm至0.6nm的15个距离处，间隔为0.2nm，伞电位为200kJ / mol。但是随着windows的这种分配，由于力常数不足以将拉组保持在窗口位置，所以沿着反应坐标的某些区域不被采样，因此为了使窗口之间能够实现足够的重叠，我们必须在1.3nm，1.4nm，1.9 nm和2.1nm。这些窗口的力常数为1000 kJ / mol。
伞采样模拟的初始结构是通过将肽的晶体结构与其牵引组置于窗口位置来设定，使系统最小化和平衡。由于产生初始结构涉及将肽置于双层的疏水核心中，所以通过将肽放置在从CHARMM-GUI中下载的双层预成型孔中进行，如我们之前的研究[8]所述。然后，肽和水的位置被限制，允许脂质分子在肽周围平衡，导致孔的闭合。随后释放水分子的约束，使它们平衡; 最后还释放了对肽的限制。之后，系统平衡50 ns。
为了了解蜂毒素重新取向对蜂毒素浓度的依赖性，我们模拟了含有4种蜂毒肽和128种脂质的体系。我们在头部水界面放置了三个蜂毒素分子，并将它们结合到双层表面。虽然三个蜂毒素结合到双层表面，但第四个蜂毒素被重新定向，通过拉动它的牵引组的质心。我们使用15个窗口，因为它是为1/128系统完成的，一个额外的窗口为1.4 nm，力常数为1000 kJ / mol，以增加此窗口的采样率。我们的采样模拟的初始结构以类似于P / L = 1/128的系统的模拟的方式创建。因此，首先将三个蜂毒素分子放置在具有孔的稍微高于双层的两侧并允许结合到双层。
II b）重新定向过程的常规MD模拟：为了更好地了解从并行到跨膜构象的肽重新定向动力学，我们进行了六次常规MD模拟，长度为200ns：对于P / L = 1的系统，三个模拟/ 128和3为P / L = 4/128系统。对于初始配置，当拉动组距离双层中心约1 nm，0 nm和-1 nm时，我们选择了系统的快照，在这些距离处，肽处于平行，中间和垂直构象。
模拟细节：从PDB数据库（PDB ID：2MLT）下载蜂毒素的晶体结构，并使用晶体结构的A链坐标建立系统。脂质双层由128个POPC脂质组成，每个叶片上有64个。所有模拟都使用Gromacs包进行[14] ; [15]：版本4.0.5。Melittin被描述为GROMOS96力场[16]和POPC脂质与Berger力场参数[17]。Melittin的净电荷为+ 6，因为其N-末端被质子化，因此加入6个Cl -离子以中和该系统。水分子由SPC潜力描述。将所有体系溶解在0.1M NaCl溶液中，类似生理条件。温度使用鼻胡佛恒温器保持在310K [18] ; [19]。压力保持在1巴，使用与Parrinello-Rahman压力调节器[20]的半各向同性压力耦合。温度和压力耦合常数设定为0.5 ps。模拟时间步长为2 fs。粒子网Ewald [21] ; [22]计算静电相互作用的方法，也使用LINCS算法 [23]来约束共价键长度和周期性边界条件。平均力（PMF）的电位是使用Gromacs的g_wham应用中实现的加权直方图分析方法（WHAM） [24]得到的 。 [25]。使用GROMACS中的g_density和g_rms脚本计算密度和均方根位移。二维结构分析采用DSSP模块进行[26]。使用Xmgrace绘制PMF，使用VMD可视化快照[27]，并使用MATLAB®（2011a）显示2D图。